Sunday, November 13, 2011

PERBEDAAN FUNGSI ESENSIAL UNTUK Cdc42 DAN rac1 DALAM PENGATURAN SEL SCHWAN SELAMA PERKEMBANGAN PNS (PERIPHERAL NERVOUS SYSTEM)

PERBEDAAN FUNGSI ESENSIAL UNTUK Cdc42 DAN rac1 DALAM PENGATURAN SEL SCHWAN SELAMA PERKEMBANGAN PNS (PERIPHERAL NERVOUS SYSTEM)

Abstrak
Perkembangan PNS melalui proses mielinisasi. Mielinisasi mampu mempercepat potensial aksi sepanjang axon, dalam hal ini merupakan syarat mutlak sebagai fungsi normal dari sistem saraf. Dalam perkembangannya PNS ini berasal dari neural crest yang akan tumbuh membentuk selubung axon. Sel-sel ini akan berproliferasi dan berdeferensiasi menjadi sel schwan yang immature (belum matang). Sel-sel ini akan memperluas pembentukan sitoplasma menjadi selubung-selubung axon yang kemudian memisah dan membentuk individu-individu axon, proses ini dinamakan “radial sorting”. Selama proses berlangsung benang-benang saraf (axon) yang berukuran besar akan termielinisasi, sedangkan benang-benang saraf yang kecil (sisanya) akan diikat oleh sel schwan yang tidak termielinisasi.
Selama proses mielinisasi PNS, sel schwan harus mampu mengartikan sinyal-sinyal dari extracellular sehingga ia dapat mengatur perkembangan intrinsic secara benar. Untuk itu diperlukan suatu faktor-faktor pertumbuhan dan protein essensial yang biasanya didapat dari golongan “Rho”. Anggota dari golongan Rho yang memiliki karakteristik terbaik adalah Cdc 42, rac1, GTPase, dan Rho A. Mereka terkenal sebagai penghubung stimuli extracel dalam pengaturan cytoskeleton actin. Cdc 42 dibutuhkan dalam proliferasi sel schwan secara normal, pengaturan rac1 untuk proses perluasan dan stabilisasi sel schwan sepanjang pembentukan “radial sorting” secara efisien dari selubung axon. Sebagai tambahannya Rho GTPase diekspresikan oleh sel schwan dan berfungsi untuk mengontrol dinamika mikrotubulus, polaritas sel, lalu lintas membran, dan transkripsi gen.
Dalam penelitian ini kita mempelajari fungsi sinyal Cdc42 dan rac1 dalam perkembangan PNS dengan menggunakan jaringan spesifik kondisional pelepasan gen secara spesifik yang berasal dari sel schwan. Pelepasan Cdc 42 maupun rac1 akan melemahkan radial sorting dari axon, namun mereka akan bekerja secara terpisah selama proses perkembangan sel schwan berlangsung. Lebih jauh lagi dapat kita ketahui bahwa aktivasi cdc42 dapat diinduksi oleh neuregulin-1 (NRG1), sedangkan rac1 akan diaktivasi oleh  1 integrin.

Bahan dan Cara Kerja
– Kondisi tikus
Untuk mendapatkan mutan Cdc42 dan rac1 maka kami menyilangkan tikus homozygot untuk alel Cdc42 dengan tikus heterozygot untuk alel Cdc42. Untuk generasi dari CNP-Cre  1 integrin mutan dan tikus kontrol telah tersedia.

– EM
Tikus terlebih dahulu telah dianastesi dengan pentobarbital. kemudian disiram dengan 0,1 buffer phospate, pH 7,4 kemudian diikuti oleh buffer yang terdiri dari 3% glutaraldehyde dan 4% PFA. Fiksasi jaringan dengan akhir fiksasi di dalam 2% osmium tetroxide kemudian didehidrasi dan ditanam dalam resin spurrs. Untuk irisan semi tipis diwarnai dengan toluidin biru untuk analisis pada mikroskop cahaya. Dan untuk irisan ultra tipis telah diwarnai dengan 3% uranyl acetate dan 1% citrat sebelum diobservasi di mikroskop elektron transmisi.

– Immunofluorescence, pewarnaan TUNEL, dan pewarnaan X-gal
Setelah difiksasi dengan 4% PFA, irisan saraf sciatic telah diblok selama 1jam dengan serum kambing dan 0,1%triton X-100 di PBS. kemudian diinkubasi dengan antibody primer yang telah terbentuk semalaman pada suhu 4oC. Pada hari berikutnya irisan jaringan telah dicuci dalam PBS dan diinkubasi dengan antibody sekunder selama 1jam dalam ruangan yang bersuhu tetap. kultur SC tikus telah difiksasi dengan 4% PFA dalam buffer MP selam 10 menit. Sel-sel telah dipemeabilitaskan terhadap 0,2% triton X-100 dibuffer MP selama 5 menit. Apoptosis kematian sel telah telah dianalisis dengan pewarnaan TUNEL menggunakan biotin labeled UTP dan FITC. Sel-sel dan irisan jaringan telah divisualisasi dengan menggunakan mikroskop fluorescence.



– Kultur sel primer
Sel schwan tikus telah diisolasi dari tikus Wistar dan ditumbuhkan di medium SC, yang terdiri dari 10% FCS, 50 g/ml gentamicin, 100 g/ml GGF kasar, dan 2 M forskolin. Jaringan saraf sciatic telah dihomogenasi dengan mortar dingin dalam buffer pelisis. Ekstrak yang diperoleh diproses dengan menggunakan prosedur SDS-PAGE standart.

– Analisis statistik
Data dianalisis dengan menggunakan rata-rata SD menggunakan t test. Kebenaran diatur pada P < 0.05 ; **, P < 0.01 ; *** , P < 0.001. di mana n mewakili jumlah dari masing-masing eksperimen.

Hasil dan Pembahasan
Penggunaan jaringa spesifik kondisional pemisahan gen kita tunjukkan dengan fungsi penting dari Rho GTPase kesil Cdc42 dan rac1 selama mielinisasi PNS. Cdc 42 dibutuhkan untuk proliferasi SC pada permulaan dari radial sorting, dimana rac1 juga diperlukan untuk proses perluasan dan stabilisasi SC selama proses radial sorting dari selubung-selubung axon. Dari hasil pengamatan kami dapatkan bahwa meskipun aktivitas rac1 spesifik tegantung pada 1 integrin, dan Cdc 42 diaktifkan oleh NRG1 hal ini mendukung bahwa aktfitas dari kedua GTPase ini dalam sel-sel schwan adalah teratur.












Gambar disamping menunjukkan bahwa meskipun Cdc42 dan rac1 bekerja sendiri-sendiri tetapi mereka mempunyai fungsi penting selama perkembangan SC. Meskipun rac1 dapat diaktivasi oleh sinyal 1 integrin dan berfungsi dalam proses perluasan dan stabilisasi SC, Cdc 42 diaktivasi oleh NRG1 dan sangat diperlukan untuk proliferasi SC. Meskipun begitu keduanya sangat penting untuk efisiensi proses radial sorting dari selubung axon.



Kehilangan rac1 di sel-sel schwan dapat menyebabkan hypomielinasi di postnatal saraf sciatic dari tikus mutan hal ini ditandai dengan kerasnya selubung axon selama proses perkembangan. Seperti halnya juga kekurangan radial sorting dapat digambarkan pada laminin tikus mutan. Laminin-2 merupakan bentuk laminin terbanyak yang ada dalam PNS.
Integrin merupakan reseptor yang paling penting untuk protein ECM, termasuk laminin. Di dalam rac1 saraf mutan, terdapat bebepara keabnormalitasan dari proses perluasan dan stabilisasi SC diantaranya adalah : (1) ketidakmampuan dari SC yang masih immature untuk menyelubungi bungkusan-bungkusan axon, (2) Banyaknya formasi yang abnormal dari tonjolan-tonjolan sitoplasma yang meluas tak terarah dari permukaan SC-axon pada tahap promielinisasi.





Kesimpulan
– Cdc42 dan rac1 mempunyai fungsi essensial dalam pengaturan SC selama proses perkembangan PNS.
– Cdc42 dan rac1 bekerja sendiri-sendiri selama proses belangsung tetapi mereka mempunyai fungsi penting dalam efisiensi radial sorting dan mielinisasi.
– Cdc42 diaktifkan oleh NRG1 dan sangat dibutuhkan dalam proses proliferasi SC.
– Rac1 diaktifkan oleh sinyal 1 integrin dan berfungsi dalam proses perluasan dan stabilisasi SC.

Saran
– Dari penelitian ini kami menyarankan bahwa untuk diteliti lagi apakah ada efeksamping dari kerja Cdc42 dan rac1 yang mungkin dapat mempengaruhi atau bahkan menghambat perkembangan sistem saraf yang lainnya ?
– Saran yang kedua adalah apakah ada pengganti lain dari Cdc42 dan rac1 yang mungkin dapat dibuat secara sintesis yang fungsinya sama yaitu untuk membantu proses perkembangan PNS ?

0 komentar:

Post a Comment

BUDAYA BERKOMENTAR SANGAT BAIK... AYO BERKOMENTAR!!

Follow Twitterku

Tukar Link Blog Yuk