PENGHITUNGAN KUANTITAS MIKROBA : HITUNGAN CAWAN (TPC) DAN BIOMASSA (METODE TURBIDIMETRIK)

Perhitungan Kuantitas Mikroba : Hitungan Cawan Petri (PTC) dan Biomassa Sel (Metode Turbidimetrik)

A. Tujuan

1. Memahami teknik seri pengenceran dan penentuan konsentrasi biomassa bakteri yang viable dengan metode hitung cawan petri.

2. Penentuan turbiditas suatu kultur mikroba dengan menggunakan spektofotometer dan kerelasinya terhadap hitungan sel yang bersangkutan.

B. Landasan Teori

Analisis material berupa makanan, air, susu, dan udara dalam hal – hal tertentu membutuhkan perhitungan jumlah mikroorganisme. Metode yang dapat dilakukan untuk memenuhi hal tersebu antara lain : penghitungan mikroskopis langsung, elektronik sel counter seperti misalnya Coulter counter, metode kimiawi untuk mengetahui massa sel atau penyusun seluler, pengukuran turbidimetri untuk peningkatan massa sel, dan penghitungan total koloni pada cawan yang menggunakan metode pengenceran agar cawan.

1. Metode Hitungan Cawan

Metode hitungan cawan didasrkan pasa anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang biak menjadisatu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan mengandung indeks bagi jumlah mikroorganisme yang dapat terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dalam metode ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah masing-masing cawan diamati. Untuk memenuhi persyaratan statistic, cawan yang dipilih untuk pengitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 koloni. Karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi persyaratan tersebut, harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan menggunakn jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.

2. Metode Turbidimetric

Metode turbidimetrik merupakan metode pengukuran kekeruhan biakan dengan fotokolorimeter. Namun agar data yang diperoleh pengukuran ini dapat dinyatakan sebagai konsentrasi organism, diperlukan suatu kurva standart yang menyatakan korelasi antara kekeruhan dengan jumlah organisme per-ml biakan. Kurva semacam ini diperoleh dengan cara menggunakn metode hitungan cawan untuk menggunakan metode hitungan organisme di dalam biakan yang kekeruhannya diketahui.

Sekali kurva biakn ini diperoleh, maka sejumlah biakan organism sejenis dapat dengan cepat diukur kekeruhannya dan konsentrasinya segera setelah membaca kurva standar tersebut.

Untuk memahami cara kerja fotokorimeter, sumber cahaya dalam alat tersebut memancarkan seberkas cahaya putih melalui dua buah lensa dan celah masuk kesuatu kisi difraksiyang pada gilirannya menyebarkan cahaya menjadi berkas-berkas horizontal dengan semua spectrum warna. Dari warna ungu dan ultra ungu (gelombang cahaya pendek) sampai pada warna merah (gelombang cahaya panjang). Spektrum cahaya jatuh pada layar gelap yang dilengkapi cahaya keluar. Hanya bagian spectrum yang kebetulan jatuh pada celah tersebut memasuki sampel yang akan menjadi berkas monokromatik. Panjang gelombang mana yang akan masuk melalui celah tersebut dapat diatur dengan menyesuaikan arah kisi difraksi melalui pemutaran tombol pengatur panjang gelombang alat tersebut.

Untuk mencatat optical density (OD) atau % transmitans digunakan galvanometer. Makin besar intensitas cahaya artunya semakin sedikit jumlah sel dalam suspensi. Sebelum digunakn alat tersebut harus dikalibrasi terlebih dahulu untu menetapkan 100% T. setelah dikalibarasi maka kekeruhan sampel biakn dapat dibaca dengan menaruh tabung berisi biakan tersebut kedalm sampel alat tersebut. Melalui perhitungan, nilai %T kemudian diubah dan dinyatakan sebagai nilai absorbans (A) atau rapat optik (optikal density atau OD).

C.Alat dan Bahan

Alat :

1.tabung reaksi.

2.tabung fotokolorimeter.

3.pipet steril.

4.cawan Petri steril.

5.spektrofotometer.

6.mesin pengocok.

7.Bunsen.

Bahan :

1.kultur yeast.

2.media SDA steril.

3.air fisiologis.

4.alkohol.

5.kapas.

6.aluminium foil.

7.tissue.

D.Prosedur

1. Menyiapkan 7 tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml air fisiologi steril dengan label 10^-1, 10^-2,…10^-7 untuk pengenceran.
2. Mengocok suspensi biakan yeast yang OD (optical density) nya telah ditentukan yaitu 0,32.
3. pipet 1 ml suspensi tersebut dan pindahkan ke tabung reaksi yang berlaber 10^-1 kemudian kocok dengan mesin pengocok. Ulangi langkah tersebut sampai tabung reaksi 10-7.
4. Memindahkan 1ml suspensi dari tabung reaksi 10^-4, 10^-5, 10^-6 dan 10^-7 ke dalam cawan Petri dengan label yang sama.
5. Menuangkan media SDA ke dalam cawan Petri yang telah berisi biakan yeast tersebut.
6. Menghomogenkan kemudian tunggu sampai padat.
7. Meletakkan pada posisi terbalik dan menginkubasi pada suhu kamar selama 2 hari.
8. mengamati pertumbuhan dengan menghitung populasi koloni yang muncul.

E. Hasil Pengamatan

Kelompok	OD Prediksi	OD Sebenarnya	Nilai Pengenceran	TPC
1	0.05	0.05	10-1	∞
			10-2	2307 X 102
			10-3	577 X 103
			10-4	79 X 104
2	0.1	0.11	10-2	3366 X 102
			10-3	274 X 103
			10-4	96 X 104
			10-5	3 X 105
3	0.2	0.22	10-3	67 X 103
			10-4	115 X 104
			10-5	14 X 105
			10-6	4 X 106
4	0.3	0.32	10-4	155 X 104
			10-5	14 X 105
			10-6	1 X 106
			10-7	1 X 106
5	0.4	0.47	10-6	4 X 106
			10-7	6 X 107
			10-8	1 X 108
			10-9	2 X 109

Tabel nilai adsorbansi dengan rata-rata jumlah koloni(30-300) :

Nilai adsorbansi (OD)	Jumlah Koloni
0,05	79X104
0,11	96X104
0,22	115X104
0,32	155X104
0,47	4X106

Panjang gelombang (λ) yang digunakan = 600 nm

F. Pembahasan

Kegiatan kali ini bertujuan untuk memahami dan mengetahui teknik seri pengenceran dan penentuan konsentrasi biomassa bakteri yang viable dengan metode hitungan cawan (TPC) dan untuk penentuan turbiditas suatu kultur mikroba dengan menggunakan spektrofotometer dan korelasinya terhadap hitungan sel Saccharomyces cerevisiae. Metode yang dapat dilakukan untuk memahami hal tersebut antara lain : penghitungan mikroskopis langsung, elektronik sel counter seperti misalnya Coulter counter, metode kimiawi untuk mengetahui massa sel atau penyusun seluler, pengukuran turbidimetri untuk peningkatan massa sel, dan penghitungan total koloni pada cawan yang menggunakan metode pengenceran seri-agar cawan.

Kami menggunakan rumus pengenceran N₁ x V₁ = N₂ x V₂ untuk mendapatkan nilai volume SDA pada OD awal (V₁). Kami menggunakan volume total sebesar 10 ml untuk setiap OD yang yang diberikan

Dari hasil praktikum kami mendapatkan jumlah koloni yang mendekati 30 sampai 300, yaitu:

Nilai adsorbansi (OD)	Jumlah Koloni
0,05	79X104
0,11	96X104
0,22	115X104
0,32	155X104
0,47	4X106

Dari grafik kami mendapat nilai korelasi dari rata-rata jumlah koloni dengan nilai adsorbansi yaitu sebesar :

y = 1,5885x+5,7747 dan R²= 0,9279

Nilai koefisien determinan (R²) dari korelasi rata-rata jumlah koloni dengan nilai adsorbansi yang kami dapatkan mendekati angka 1 berarti mendekati tepat. Karena nilai keofisien determinasi (R²) yang tepat adalah 1.

Semakin banyak jumlah sel alam suspensi, makin besar intensitas cahaya yang lolos dan makin tinggi pula % transmitans yang tercatat.

Dalam praktikum ini terdapat kesalahan yang menyebabkan data tidak sempurna. Antara lain :

1. Kurang telitinya praktikan dalam bekerja
2. Kurang sterilnya alat
3. Adanya faktor lingkungan yang mempengaruhi kinerja praktikan

4. Keterbatasan waktu dalam melakukan praktikum

G. Kesimpulan

Nilai turbiditas dari suatu kultur mikroba Sacharomyces cereviceae dengan menggunakan spektrofotometer yaitu :

1. Jumlah koloni bertambah pada setiap kenaikan OD,

Pada OD 0,05 rata-rata jumlah koloninya adalah 79X10⁴

Pada OD 0,11 rata-rata jumlah koloninya adalah 96X10⁴

Pada OD 0,22 rata-rata jumlah koloninya adalah 115X10⁴

Pada OD 0,32 rata-rata jumlah koloninya adalah 155X10⁴

Pada OD 0,47 rata-rata jumlah koloninya adalah 4X10⁶

2. Nilai regresi dan korelasi antara nilai adsorbansi masing-masing pengenceran dengan jumlah koloni masing-masing pengenceran adalah y = 1,5885x+5,7747 dan R²= 0,9279

H. Daftar Pustaka

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan

Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama

Schlegel, Hans G. 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : UGM Press

Volk & Wheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga