PENGECATAN MIKROBA

PENGECATAN MIKROBA : PENGECATAN SEDERHANA, GRAM dan SPORA

TUJUAN
Bab ini dirancang untuk memberi pengetahuan dan ketrampilan mahasiswa dalam hal :
1. Dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan biologis
2. Teknik preparasi smear
3. Pewarnaan sederhana dan differensiasi ( gram dan kapsul )

PENDAHULUAN
Visualisasi mikroorganisme yang masih hidup tidaklah mudah, tidak hanya karena ukurannya yang sangat kecil tetapi karena transparan dan pada umumnya tidak berwarnajika disuspensikan dalam medium cair. Untuk mempelajari sifat mereka dan untuk mendiferensiasikan mikroorganisme dalam grup yang spesifik untuk kepentingan diagnostik, pewarnaan bologis dan prosedur pewarnaan dengan bantuan mikroskop cahaya menjadihal utama dalam mikrobiologi.
Secara kimiawi, pewarna (cat) merupakan senyawa organik dengan cincin benzena dengan golongan kromofor atau auksokrom.
Benzena : Larutan organik tidak berwarna
Kromogen :
+ Senyawa berwarna
bukan cat Pewarna
Kromofor : Golongan senyawa kimia yang
+ mewarana pada bezena
Auksokrom: Senyawa kimia yang membawa sifat
ionisasi dari kromogen (mampu mem-
bentuk garam) dan berikatan dengan
serat atau jaringan




Pewarna asam pikrat dapat digunakan untuk menggambarkan definisi ini :








Kemampuan suatu pewarna untuk mengikat komponen makromolekul seluler seperti protein atau asam nukleat bergantung pada muatan elektrik pada bagian kromofor yang sesuai dengan komponen seluler yang terwarna.

Cat asam merupakan anionik, berarti pada ionisasi pewarna bagian kromofor yang menunjukkan muatan negatif sehingga mempunyai afinitas yang kuat untuk unsur positif sel. Protein memberi muatan positif pada kmponen sel, akan berikatan dengan dan menerima warna yang bermuatan negatif., anionik, kromogen dari suatu pewarna negatif. Secara struktur asam pikrat merupakan contoh dari suatu pewarna asam yang menghasilkan kromogen anionik.

Cat basa merupakan kationik, karena ionisasi bagian kromgen menunjukkan muatan positif sehinggga mempunyai afinitas yang kuat untuk unsur negatif sel. Asam nukleat bermuatan negatif, komponen seluler akan mengikatdan menerima warna yang bermuatan positif, kationik dari pewarna basa. Secara struktural, Metilen biru adalah suatu pewarna basa yang menghasilkan kromogen kationik.
Berikut ini adalah ringkasan dari pewarna asam dan basa :

Asam Garam sodium, pottasium, kalsium, atau ammonium dari asam berwarna terionisasi memberi muatan negatif pada kromogen
pewarna

Basa Garam klorida atau sulfat basa berwarna terionisasi memberi muatan positif pada kromogen

Terdapat sejumlah teknik pewarnaan untuk visualisasi, diferensiasi, dan pemisahan bakteri dalam hal karakteristik morfologis dan stuktur seluler. Ringkasan prosedur yang digunakan secra umum dan tujuannya digariskan dibawah ini :














Semua prosedur pewarnaan mikrobiologis membutuhkan preparasi smear sebelum perlakuan pada tiap teknik spesifik pewarnaan yang tercantum dibawah ini. Tekniknya meskipun sulit, memerlukan ketelitian yang cukup untuk preparasinya. Peraturan dasar berikut harus diikuti secra cermat.
1. Preparasi pada slide : Kebersihan merupakan hal yang penting untuk preparasi smear mikroba. Lemak atau minyak dari jari pada slide harus dihilangkan dengan memcuci slide dengan sabun dan air atau bubuk gosok, diikuti dengan bilasan air dan bilas dengan alkohol 95%. Slide harus dikeringkan dan disimpan pada laplaboratorium sampai siap digunakan.
2. Preparasi smear : hindari terlalu tebal, ketebalan smear sangat penting. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. Untuk pembuatan dari kultur broth atau kultur medium padat memerlukan teknik yang berbeda.
a. Kultur Broth (cair) : Satu tau dua loop suspensi sel langsung letakkan pada slide dengan loop inokulasi sterildan oleskan merata pada area tertentu kira-kira seukuran koin.
b. Kultur dari medium padat : kultur organisme pada medium padat cukup tebal, ketebalan pertumbuhan ada dipermukaan dan dianjurkan tidak langsung dipindahkan ke slide. Kultur ini harus diencerkan terlebih dahulu dengan meletakkan satu loop penuh air pada slide dimana kemudian sel akan diemulsikan. Pindahkan sel dari kultur yang diingikan menggunakan jarum inokulasi steril. Hanya ujung jarum yang disentuhkan pada kultur untuk menghindari pemindahan terlalu banyak sel. Suspensi dilakukan dengan meratakan sel dengan gerakan sirkuler pada tetes air dengan ujung jarum. Terakhir smear harus berupa area seukuran koin logam dan nampak semitransparan, rata, dan putih tipis. Sebelum melanjutkan prosedur, smear harus kering sempurna.
3. Fiksasi Panas : Jika slide tidak difiksasi, smear bakteri akan tercuci selama prosedur pewarnaan. Hal tersebut dihindari dengan fiksasi panas, selama melakukan fiksasi protein bakteri terkoagulasi dan menempel pada permukaan slide. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-udarakan dua atau tiga kali pada api bunsen.

A. PEWARNAAN SEDERHANA
Bahan
1. Kultur murni bakteri ( E. Coli, Bacillus subtilis,Staphilococcus aureus )
2. Zat pewarna basa: kristal violet
3. Alkohol 90 %
Alat
1. Mikroskop cahaya
2. Bunsen
3. Jarum Ose
4. Kaca Obyek
5. Kaca Cover
B. PEWARNAAN GRAM
Bahan
1. Kultur murni bakteri ( E. Coli, Bacillus subtilis,Staphilococcus aureus )
2. Zat pewarna asam : kristal violet, lugol dan safranin
3. Alkohol 95 %
4. Minyak emersi
5. Air
6. Kertas penyerap
Alat
1. Mikroskop cahaya
2. Bunsen
3. Jarum Ose
4. Kaca Obyek
5. Kaca Cover
C. PEWARNAAN SPORA
Bahan
1. Kultur murni bakteri ( E. Coli, Bacillus subtilis,Staphilococcus aureus )
2. Zat pewarna: malakit green
3. Alkohol 95 %
4. Minyak emersi
5. Air
6. Kertas penyerap
Alat
1. Mikroskop cahaya
2. Bunsen
3. Jarum Ose
4. Kaca Obyek
5. Kaca Cover

PEMBAHASAN

Pada umumnya sel bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit untuk dilihat atau diteliti sekalipun dibawah mikroskop. Hal tersebut disebabkan karena banyak mikrobe yang tidak mempunyai zat warna, seperti pada umumnya didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga yang jelasmempunyai butir – butir atau serat – serat warna dalam selnya.

Bakteri yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun sifat morfologinya. Mikroorganisme sangat sulit diamati dengan mikroskop cahay, karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Dengan alasan inilah yang meyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga mikroorganisme tersebut terlihat kontras dengan sekelilingnya.

Dalam proses pewarnaan dilakukan juga proses fiksasi yang berguna agar mikroorganisme mati dan melekatkan mikroba pada obyek glass.

Metode pewarnaan mikroba :

1. Pewarnaan Sederhana yaitu dengan hanya menggunakan satu zat warna.digunakan untuk mengetahui bentuk sel bakteri : kokus, batang, basil, vibrio, spiral) serta morfologi dan susunan selnya.

Pewarna yang biasa digunakan yaitu : metilen blue, safranin, karbolfuksin, kristal violet.

2. Pewarnaan Gram yaitu pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri gram positif atau bakteri gram negatif.

Pewarna yang digunakan yaitu

- Gram A : sebagai pewarna utama.contohnya : kristal violet. Zat ini menyebabkan bateri gram positif atau negatif berwarna ungu.

- Gram B : sebagai mordant yaitu mengikat pewarna utama.zatnya yaitu iodine yang berwarna coklat.

- Gram C : alkohol. Pada bakteri gram positif karena dinding selnya tebal maka bakteri mengalami dehidrasi sehingga pori – pori menciut yang menyebabkan zat warna utama tidak keluar. Pada bakteri gram negatif karena dinding selnya tipis, tidak mengalami dehidrasi sehingga pori – porinya membuka yang menyebabkan zat warna utama keluar.

- Gram D : sebagai pewarna tandingan yaitu hanya bisa masuk jika pewarna utama hilang. Zatnya berwarna merah.

Dari hasil pewarnaan gram diperoleh hasil :

· Bakteri gram positif berwarna ungu

· Baktri gram negatif berwarna merah

3. Pewarnaan Spora

Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan cara dipanskan. Pemanasan dimaksudkan agar lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk. Zat warna yang digunakan yaitu larutan hijau malakit dan larutan safranin. Dalam hal ini safranin bukan pewarna tandingan. Safranin mewarnai sel vegetatif dari bakteri. Sebaiknya dalam percobaan malakit green digunakan dalam jumlah yang cukup banyak.

1. Bakteri Staphylococcus aureus

1. Teknik pewarnaan sederhana

Dari hasil pengamatan, setelah dilakukan pewarnaan sederhana dengan zat warna safranin pada bakteri Staphylococcus aureus, diperoleh suatu bentuk morfologi dari bakteri tersebut antara lain sebagai berikut:

- bentuk sel bakteri bulat

- membentuk suatu koloni yang bentuknya seperti anggur

- warna sel merah

b. Teknik pewarnaan gram

Setelah melalui teknik pewarnaan gram, bakteri Staphylococcus aureus berwarna ungu. Hal ini berarti bahwa bakteri ini termasuk bakteri gram +, dimana dinding selnya tebal sehingga mampu mempertahankan warna ungu yang berasal dari pewarna kristal violet meskipun telah dilakukan dekolorisasi dengan alcohol 95%.

2. Bakteri Basillus sp

1. Teknik pewarnaan gram

Seperti halnya bakteri Staphylococcus aureus, bakteri Basillus sp menunjukkan hasil yang sama, yaitu bakteri berwarna ungu (gram +). Warna ungu tersebut berasal dari kristal violet yang tetap dipertahankan oleh sel bakteri Basillus sp meskipun telah didekororisasi dengan alcohol 95%. Selain itu, adapun factor yang menyebabkan warna ungu, yaitu kandungan lipid pada dinding sel Staphylococcus aureus sedikit, dimana setelah didekolorisasi,pori-pori selnya menyusut, sehingga mampu mempertahankan kristtal violet.

2. Teknik pewarnaan spora

Pada hasil pengamatan, setelah pewarnaan spora pada Basillus sp dengan zat pewarna malakit green terlihat adanya spora yang berada di bagian tengah sel dan berwarna hijau transparan.

3. Bakteri E. coli

1. Teknik pewarnaan sederhana

Dari hasil pengamatan, setelah dilakukan pewarnaan sederhana dengan zat warna metilen blue pada bakteri E.coli, diperoleh suatu bentuk morfologi dari bakteri tersebut antara lain sebagai berikut:

- bentuk sel bakteri batang

- warna sel ungu

b. Teknik pewarnaan gram

Setelah melalui teknik pewarnaan gram, bakteri E. coli berwarna merah. Hal ini berarti bahwa bakteri ini termasuk bakteri gram -, dimana dinding selnya tipis dan sehingga tidak mampu mempertahankan warna ungu yang berasal dari pewarna kristal violet. Serta pori-pori sel membesar saat didekolorisasi dengan alcohol 95% karena mengandung banyak lipid pada dinding selnya.

KESIMPULAN

Teknik Pewarnaan Mikroba

Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Differensial

Untuk mengetahui Pemisahan Dalam kelompok Visualisai struktur

morfologi bakteri Pewarnaan Gram Pewarnaan flagel

Pewarnaan Tahan asam Pewarnaan Kapsul

Pewarnaan Spora

Pewarnaan Inti

DAFTAR PUSTAKA

1.Waluyo,Lud.Drs.M.Kes.2004.Mikrobiologi Umum.Universitas Muhammadiyah Press : Malang.

2.Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta.