PENGENALAN ALAT DAN TEKNIK STERILISASI

A. TUJUAN

Mengenalkan pada mahasiswa :

1. Jenis-jenis alat laboratorium yang diperlukan dalam penelitian
mikrobiologi
2. Konsep dan teknik sterilisasi dan prosedur yang harus dilakukan untuk
keberhasilan pengkulturan


B. LANDASAN TEORI

Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
• Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

• Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.


C. ALAT DAN BAHAN

C.1 Alat :
1. pembakar bunsen
2. jarum ose
3. pipet
4. tabung reaksi
5. labu erlenmeyer
6. gelas beaker
7. cawan petri
8. laminar air flow
9. oven
10. autoklaf
11. botol semprot
12. kertas tissue

C.2 Bahan :
1. kertas sampul coklat
2. aluminium foil
3. kapas
4. alkohol 70%

D. PROSEDUR
D.1 Prosedur Sterilisasi Area Kerja
1) Masukkan larutan alkohol dengan kadar 70% ke dalam botol semprot.
2) Semprotlah udara di sekitar area kerja dengan alkohol tersebut.
3) Semprotlah juga meja kerja dengan alkohol dan ratakan dengan kertas tissue.
4) Semprot juga tangan kita agar steril.
5) Letakkan alat-alat yang akan digunakan pada meja kerja.
6) Semprot kembali tangan kita ketika hendak menggunakan alat-alat tersebut.


D.2 Prosedur Sterilisasi Dengan Pembakaran (Nyala Bunsen)
1) Nyalakan pembakar bunsen dengan cara membuka tutupnya.
2) Sterilkan jarum ose dengan membakar ujung jarum yang terbuat dari logam pada api bunsen. Peganglah jarum dengan posisi agak tegak di atas api ( 45), bakar jarum hingga berpijar dan pijaran tersebut merambat hingga pangkal bagian logam jarum.

3) Bila sudah selesai, tunggu beberapa detik hingga suhu ose kembali normal. Atau sentuhkan ujung ose pada permukaan media hingga terdengar bunyi ”ches”

D.3 Prosedur Sterilisasi Panas Lembab (Dengan Autoklaf)
1) Pastikan air dalam autoklaf cukup (tinggi air  2 cm) di bawah dasar keranjang) atau sebanyak 3-5 liter.
2) Aturlah alat-alat yang akan disterilkan ke dalam keranjang autoklaf dalam posisi dimana kira-kira seluruh permukaan alat dapat terjangkau oleh uap dalam autoklaf.
3) Tutuplah autoklaf dengan erat, kemudian atur pengontrol waktu pada angka 20 (20 menit) dan pastikan pengontrol exhaust dalam keadaan terbuka dan pengontrol drain dalam keadaan tertutup.
4) Setelah uap naik, yaitu ditandai dengan keluarnya uap dari selang pembuangan diiringi dengan bunyi mendesis, maka tutuplah lubang exhaust.
5) Setelah autoklaf bekerja selama  20 menit dan sudah terdengar alarm tanda selesai, jangan langsung membuka tutup autoklaf. Tetapi tunggu sampai penunjuk tekanan menunjuk pada angka 0

D.4 Prosedur Sterilisasi Panas Kering (Dengan Oven)
1) Buka tutup oven dan masukkan peralatan dari gelas yang sudah dibungkus ke dalam oven.
2) Tutup oven dan atur pengontrol suhu pada angka 160-180C selama 1-2 jam

D.5 Prosedur Sterilisasi Secara Radiasi (Dengan Laminar Air Flow)
1) Seka permukaan laminar dengan alkohol 70%.
2) Letakkan alat dan bahan yang akan disterilkan ke dalam laminar.
3) Tutup tirai serapat mungkin sampai dirasa tidak akan ada cahaya yang keluar.
4) Nyalakan laminar (tombol UV) minimal 15 menit.
5) Matikan tombol UV bila sudah selesai.
6) Buka tirai dan nyalakan blower ketika akan bekerja.
7) Bila kurang terang, nyalakan tombol light


E. PEMBAHASAN

Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus melalui proses sterilisasi. Sterilisasi berasal dari kata steril yang artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang mengganggu ataupun merusak media bahkan mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi.

1. Sterilisasi Secara Fisik
Cara ini dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat temperatur tinggi atau tekanan tinggi. Cara membunuh mikroba ini dengan memakai panas (Thermal Kill). Cara kerja dari panas tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim-enzim, dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat dimatikan daripada dipanasi secara kering.

a. Pemanasan Basah

* Autoklaf
Alat ini serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap air. Autoklaf memiliki suatu ruangan yang mampu menahan tekanan diatas 1 atm. Dalam autoklaf, yang mensterilkannya adalah panas basah, bukan pada tekanannya. Oleh karena itu setelah air dalam tangki mendidih dan terbentuk uap air, maka uap air ini mengalir ke ruang pensteril guna mendesak keluar semua udara di dalamnya. Jika masih ada udara yang tersisa, maka udara ini akan menambah tekanan di dalam ruang pensteril yang akan mengganggu naiknya suhu dalam ruang tersebut.
Alat-alat dan bahan-bahan yang disterilkan lebih baik ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpulkan dalam satu botol yang besar. Setelah pintu autoklaf tertutup rapat barulah kran pada pipa uap dibuka, dan temperatur akan terus naik sampai 1210C. Biasanya autoklaf diatur sedemikian rupa sehingga pada suhu tersebut, tekanannya ada 1 atm/1cm2. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit dimulai semenjak termometer pada autoklaf menunjuk 1210C. Setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan dengan demikian suhu mulai turun sedikit demi sedikit, demikian pula dengan manometer. Autoklaf tidak boleh dibuka terburu-buru agar isi botol yang ada di dalam autoklaf tidak meluap kemana-mana. Sebaiknya kita menuggu sampai manometer menunjukkan angka nol barulah autoklaf dibuka.

*Tyndalisasi
Metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari, selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif, maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut didididhkan sekali lagi. Dengan jalan demikian diperoleh medium yang steril, dan zat-zat organik yang terkandung di dalamnya tidak mengalami banyak perubahan.

b. Pemanasan Kering

*Oven.
Sterilisasi ini dengan menggunakan udara panas. Alat-alat yang disterilkan ditempatkan dalam oven dimana suhunya dapat mencapai 160-1800C. Caranya adalah dengan memanaskan udara dalam oven tersebut dengan gas atau listrik. Oleh karena adanya penetrasi panas kering tidak sebaik panas basah, maka waktu yang diperlukan pada sterilisasi cara ini lebih lama yakni selama 1-2 jam. Sterilisasi cra ini baik dipergunakan untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti cawan petri, pipet, tabung reaksi, labu, dan lain sebagainya.

*Pembakaran.
Pembakaran merupakan cara sterilisasi yang 100% efektif tetapi cara ini terbatas penggunakannnya. Cara ini biasa dipergunakan untuk mensterilkan alat penanam kuman (jarum ose/sengkelit). Yakni dengan membakarnya samai pijar. Dengan cara ini semua bentuk kehidupan akan mati. Pembakaran juga dilakukan untuk bangkai binatang percobaan yang mati.

*Penyinaran dengan Sinar Gelombang Pendek.
Mikroorganisme di udara dapat di bunuh dengan penyinaran memakai sinar ultra violet. Panjang gelombang yang dapat membunuh mikroorganisme adalah diantara 220-290 nm,radiasi yang paling efektif adalah 253,7 nm. Faktor penghambat dari sinar ultra violet adalah daya penetrasinya yang lemah. Untuk memperoleh hasil yang baik, maka bahan-bahan yang disterilkan, baik yang berupa cairan, gas atau aerosol harus dilewatkan (dialirkan) atau ditempatkan langsung dibawah sinar UV dalam lapisan yang tipis.
Absorpsi radiasi sinar ultra violet menyebabkan modifikasi kimiawi nukleoprotein dan menimbulkan hubungan silang antara pasangan-pasangan molekul timin. Hubungan ini dapat menimbulkan salah baca dari kode genetika, yang berakibat mutasi. Selanjutnya akan merusak atau memperlemah fungsi vital organisme dan kemudian akan mematikannya.

2. Sterilisasi secara Kimia.
Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap seperti halnya alkohol. Umumnya isopropil alkohol 70-90% adalah yang termurah namun merupakan antiseptik yang sangat efisien dan effektif. Penambahan yodium pada alkohol akan meningkatkan daya disinfeksinya. Dengan atau tanpa yodium, isopropil tidak efektif teerhadap spora. Solusi terbaik untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan alkohol, tetapi solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagaai antiseptik.
Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada kebutuhan dari pada tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki. Perlu juga diperhatikan bahwa beberapa senyawa bersifat iritatif, dan kepekaan kulit sangat bervariasi. Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara halogen, alkohol, fenol,hidrogen peroksida, zat warna ungu kristal, derivat akridin, rosanalin, deterjen, logam berat,aldehida, gas ETO, uap formaldehid, beta-propilakton.

3. Sterilisasi secara Mekanik.
Beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan atau penguraian, maka sterilisasi yang dilakukan adalah dengan cara mekanik, misalnya filter Berkefeld, filter Chamberland dan filter Seitz. Jenis filter yang dipakai atau yang akan dipergunakan tergantung pada tujuan penyaringan dan benda yang akan disaring. Penyaringan dapat dilakukan dengan mengalirkan gas atau cairan mmelalui suatu bahan penyaring yang memiliki pori-pori cukup kecil untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan akan tercemar sedangkan cairan atau gas yang melaluinya akan steril. Alat saring tertentu juga mempergunakan bahan yang dapat mengapsorbsi mikroorganisme. Saringan yang umum dipakai tidak dapat menahan virus. Oleh karena itu, sehabis penyaringan medium masih harus dipanasi alam autoklaf. Penyaringan dilakukan untuk mensterilkan substansi yang peka terhadap dilakukan panas seperti serum, enzim, toksin kuman, ekstrak sel, dan sebagainya.
Dalam proses sterilisasi kita menggunakan peralatan yang di antaranya adalah sebagai berikut :

•Autoklaf
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.

• Mikropipet (Micropippete) dan Tip
Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. dalam penggunaannya, mukropipet memerlukan tip.

• Cawan Petri (Petri Dish)
Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.

• Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube).
Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alasan efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.

• Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)
Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.
• Gelas ukur (Graduated Cylinder)
Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan.

•Jarum Inokulasi
Jarum inokulasi berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating).



F. KESIMPULAN

1. Macam-macam alat laboratorium yang diperlukan dalam penelitian mikrobiologi antara lain :

• Autoklaf
• Oven
• Laminar
• Pipet Volume
• Jarum Inokulasi/ Kawat Ose
• Api Bunsen
• Kapas
• Kertas Coklat/ koran
• Alkohol 70%
• Kertas Tisu
• Cawan Petri
• Labu Erlenmeyer
• Tabung Reaksi
• Rak Tabung Reaksi

2. Agar proses sterilisasi sempurna perlu melalui langkah sebagai berikut :
- Sifat dari bahan yang dipakai
- Metode sterilisasi yang sesuai

3. Teknik sterilisasi
Dalam sterilisasi terdapat beberapa metode untuk menentukan bagaimana mensterilkan suatu benda dan metode tersebut termasuk ke dalam teknik sterilisasi. Terdapat beberapa metode sterilisasi, antara lain sebagai berikut :
- Sterilisasi fisik (penggunaan panas) : biasanya dipakai untuk mensterilkan benda – benda yang tahan panas. Prosesnya meliputi
- Tyndalisasi
- Pembakaran
- Panas kering (oven)
- Panas lembab (autoklaf)
- Sterilisasi fisik (radiasi) : dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak dapat berubah atau terurai akibat temperatur tinggi. Misalnya untuk mensterilkan udara, air, plasma darah, dll.
- Sterilisasi kimia (bahan kimia) : menggunakan desinfektan, larutan alkohol atau formalin. Biasanya digunakan untuk mensterilkan media
- Sterilisasi mekanik (filtrasi) : digunakan untuk mensterilkan benda – benda cair, satu – satunya metode yang tidak membunuh mikroorganisme.





DAFTAR PUSTAKA
Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi Menguak Dunia Organisme Jilid 1. Bandung : CV. Yrama Widya.
Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
http://www.e-dukasi.net/mol/mo_full.php?moid=86&fname=kb1_7.htm tanggal 26 September 2009.
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-3-sterilisasi.html tanggal 26 September 2009.
Tim Dosen Biologi. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. Surabaya : Universitas Airlangga.